«Нарезка и окрашивание срезов: практическое введение в гистологические методы»

Краситель Нильсена для бацилл туберкулеза. — Срезы помещают в раствор карбол-фуксина Циля (стр. 103), который следует подогревать от десяти минут до получаса. Затем их обесцвечивают в растворе серной кислоты. Двадцатипятипроцентный раствор — это концентрация, рекомендованная изначально, но десятипроцентный раствор действует так же хорошо и меньше повреждает срез. Затем их очень тщательно промывают в большом количестве воды, а после этого могут быть обработаны контрастным красителем.

Двойной краситель Гиббса для бацилл туберкулеза. —

(1)Rosaniline hydrochlorate 2grms. 25grs. Methyl blue1grm.12·5grs.

Разотрите в стеклянной ступке,

(2)Aniline oil3c.c. 37·5grs. Rectified spirit 15c.c.3 1/2drms.

Растворите и медленно добавьте к (1).

(3)Lastly add slowly to the mixture Distilled water 15c.c. 3 1/2drms.

Часть раствора отфильтровывают в часовое стекло и подогревают. Срезы помещают в него и оставляют на несколько часов. Затем их промывают в метилированном спирте, пока они не будут достаточно обесцвечены, а затем быстро проводят через абсолютный спирт и гвоздичное масло и заключают в бальзам и ксилол. Это очень полезный краситель для исследования мокроты на бациллы туберкулеза.

Для окрашивания жидкостей, таких как кровь, гной или мокрота, на наличие организмов следует получить очень тонкий слой, поместив немного жидкости между двумя чистыми покровными стеклами и прижав их друг к другу. Затем их разделяют и дают высохнуть. Пленку фиксируют, удерживая покровное стекло пинцетом и медленно проводя его через пламя спиртовки два или три раза. Пленки гноя после фиксации следует «просветлить», поместив их в двадцатипроцентный раствор уксусной кислоты на три минуты.

Для клинических целей часто необходимо исследовать мочу, кал или рвотные массы на наличие бацилл. Пленки готовят обычным способом и дают медленно испариться, затем фиксируют, проводя через пламя, и перед окрашиванием промывают в дистиллированной воде. В случае рвотных масс и кала это обычно делается без труда. Однако в случае мочи часто бывает трудно добиться полного испарения. Остается сиропообразный слой, и если применить больше тепла, он разлагается и обугливается, а продукты вызывают осаждение анилина во время последующих процессов окрашивания. Этого можно частично избежать, осторожно промыв пленку в дистиллированной воде перед окрашиванием.

Другой план состоит в том, чтобы смешать мочевой осадок с небольшим количеством желатина, свободного от организмов, например, такого, как в неиспользованных культуральных пробирках. Желатин разжижают нагреванием и смешивают с осадком. Из этой смеси делают пленки, дают им застыть, а затем тщательно промывают в дистиллированной воде. Затем пленку тщательно высушивают, покровное стекло кладут плашмя пленкой вверх и фильтруют на него несколько капель окрашивающей жидкости. После того как она достаточно окрасится, краситель сливают, а стекло осторожно промывают. Затем пленку можно окрасить контрастным красителем точно так же, как срезы, снова промыть, высушить между слоями фильтровальной бумаги и заключить в бальзам.

Иногда трудно определить, на какой стороне покровного стекла находится пленка. Это легко сделать, удерживая стекло под углом так, чтобы свет из окна отражался от его поверхности. Сторона, покрытая пленкой, кажется тусклой, в то время как другая — гладкой и блестящей.

Методы исследования крови.

Во всех этих методах кровь получают путем укола кожи одного из пальцев или мочки уха, предпочтительно последней. Кожу предварительно необходимо промыть водой с мылом или эфиром, чтобы удалить жир или эпителиальные чешуйки. Прокол следует делать твердо, чтобы кровь могла свободно вытекать. Палец или ухо нельзя сжимать. Препараты должны быть сделаны быстро, прежде чем красные кровяные тельца соберутся в «монетные столбики». Используемые предметные и покровные стекла должны быть безупречно чистыми, иначе невозможно получить действительно хорошие пленки. Их следует очищать азотной кислотой и спиртом в соответствии с указаниями на странице 57.

Следует исследовать свежие препараты. Покровное стекло подводят так, чтобы оно лишь коснулось капли крови одним краем, чтобы перенести лишь небольшое количество, и сразу же опускают на предметное стекло с помощью препаровальной иглы. Если предметное и покровное стекла идеально чисты, кровь растечется в тонкую пленку, а тельца будут лежать совершенно плоско. Если будет какая-либо задержка или если покровное стекло будет не совсем чистым, красные тельца соберутся в массы, и препарат будет бесполезен для детального исследования. Другой препарат можно смешать с небольшим количеством раствора Феррье (стр. 129) перед заключением. Также можно приготовить постоянные пленки на покровных стеклах.

Здесь опять же необходимо использование абсолютно чистых покровных стекол, и кровь должна быть взята сразу же, как только она выйдет из прокола. Немного крови берут на покровное стекло, которое держат горизонтально. Другое покровное стекло опускают на него, и под действием собственного веса и капиллярного притяжения капля крови быстро превращается в тонкую пленку. Два покровных стекла разделяют, как только пленка сформировалась, быстро сдвигая их друг с друга. Этот маневр требует некоторой практики и ловкости. Движение стекол должно быть в строго параллельном направлении, иначе покрытие будет неравномерным, точно так же, как когда разрывают два куска хлеба с маслом. Даже с практикой трудно получить более одной хорошей пленки, нижняя обычно лучше. Существует четыре способа фиксации пленки.

1. Воздействие пара осмиевой кислоты.

Пленку, пока она еще влажная, держат над горлышком бутылки, содержащей по крайней мере однопроцентный раствор осмиевой кислоты. Через минуту или две фиксация будет завершена, и пленка приобретет грязно-коричневый цвет. Затем ее оставляют на воздухе, чтобы избавиться от всех следов осмиевой кислоты, и впоследствии можно окрасить, как описано ниже.

2. Обработка насыщенным водным раствором сулемы (метод Мьюира).

Покровное стекло, на которое была нанесена пленка, плавают, пока она не успела высохнуть, пленкой вниз на насыщенном растворе сулемы в часовом стекле в течение получаса. Покровное стекло помещают в дистиллированную воду, а затем в спирт, чтобы удалить излишки сулемы, после чего окрашивают. При промывке пленки требуется некоторая осторожность, чтобы она не соскользнула с покровного стекла целиком.

3. Путем высушивания и быстрого проведения через пламя горелки Бунзена, точно так же, как при подготовке препаратов мокроты и т. д. (стр. 111). Этот метод удобен для обычных клинических целей.

4. Путем выдерживания покровных стекол при температуре около 200° F (метод Эрлиха).

Эрлих использует для этой цели полоску меди шириной около двух дюймов и длиной в фут, которая поддерживается на штативе в горизонтальном положении. Один конец нагревается горелкой Бунзена снизу. Точка на медной полоске, в которой температура достигает точки кипения, легко определяется путем падения на нее небольшого количества воды. Точка, в которой капля воды принимает сферическое состояние, указывает на температуру в 212° F. Покровные стекла помещают на дюйм или два дальше этой точки и держат там при температуре около 200° F в течение нескольких часов.

Методы окрашивания.

Свежую кровь можно окрасить, смешав с раствором фуксина Феррье:

Fuchsine1grm. Distilled water 150c.c.

Растворите и добавьте

Alcohol (80 per cent.)50c.c. Neutral glycerine 200c.c.

Каплю этого раствора смешивают с кровью на предметном стекле с помощью препаровальной иглы и накрывают чистым покровным стеклом. Красные кровяные тельца слегка окрашиваются, в то время как ядра белых кровяных телец окрашиваются в ярко-малиновый цвет, а «кровяные пластинки» — в глубокий розовый цвет.

Окрашенные препараты также можно получить с помощью жидкости Туазона, которая также служит для разведения крови с целью определения точного количества красных и белых кровяных телец с помощью гемоцитометра Говерса или Тома-Цейса. Ее готовят так:

Glycerine30c.c.1oz. Sodium sulphate8grms.2drms. Sodium chloride1grm. 15grs. Methyl violet·25grm.4grs. Distilled water 160c.c.5oz.

Она окрашивает ядра и кровяные пластинки, но не изменяет форму красных клеток. Ее необходимо время от времени готовить свежей, так как в ней склонны образовываться и размножаться торулы.

Высушенные пленки можно окрашивать гематоксилином, пикрокармином или любыми общими красителями. Ядра лейкоцитов можно быстро окрасить за пару минут в однопроцентном растворе метилового фиолетового, промыв в воде, высушив между листами фильтровальной бумаги и заключив в бальзам. Лучший метод для общих целей — окрашивание насыщенным водным раствором метилового синего в течение получаса или дольше. Промойте в воде, а затем окрашивайте в течение десяти минут в полунасыщенном водном растворе эозина. Таким образом, эозинофильные гранулы лейкоцитов и красные кровяные тельца окрашиваются эозином, в то время как ядра лейкоцитов окрашиваются метиловым синим.

Кантхак и Дрисдейл рекомендуют сначала окрасить пленку полупроцентным раствором эозина в 50-процентном спирте, затем промыть, высушить и зафиксировать в пламени, а затем окрасить в течение короткого времени раствором метиленового синего Леффлера (стр. 104).

Эти пленки можно окрашивать на микроорганизмы способом, описанным для препаратов на покровных стеклах (стр. 112).

ГЛАВА VIII.

Инъекция кровеносных сосудов.

Инъекцию кровеносных сосудов можно проводить на мелких животных или на отдельных органах человека после их извлечения из организма. Цель состоит в том, чтобы заполнить сосуды окрашенной жидкостью, которая впоследствии затвердеет. В одном и том же органе можно инъецировать артерии красной средой, вены — синей, а секреторные протоки, такие как желчные протоки, — желтой или синей.

Наиболее удобной основой для инъекционной массы является желатин, так как его растворы разжижаются при температуре около 100° F и затвердевают чуть ниже этой точки, а после затвердевания легко режутся и не имеют тенденции становиться хрупкими. Различные массы готовят следующим образом:

Красная инъекционная масса (формула Вудхеда) состоит из желатина, размягченного путем смешивания с водой и окрашенного кармином.

(1)Carmine4grms. Liq. ammoniæ B.P.8grms. Distilled water 150c.c.

Растворите кармин в аммиаке в ступке. Влейте воду. Тщательно перемешайте и отфильтруйте.

(2)Gelatine10grms. Distilled water 50c.c.

Дайте постоять в холодной воде, пока вода не впитается и желатин не станет мягким.

Нагрейте (1) почти до точки кипения над горелкой Бунзена и медленно добавьте желатин. Тщательно перемешайте и добавьте десятипроцентный раствор уксусной кислоты, пока раствор не станет слегка кислым. Это будет видно по тому, что масса приобретет более темный и тусклый цвет. Можно добавить немного салициловой кислоты для консервации.

Синяя инъекционная масса. — К желатиновой массе (2), приготовленной как указано выше и разжиженной нагреванием, добавьте вместо кармина

Soluble Prussian blue5grms. Distilled water 60c.c.

Любые следы щелочи должны быть удалены от массы во время и после приготовления. Срезы инъецированных органов следует заключать в среду Фарранта, слегка подкисленную муравьиной или уксусной кислотой. Однако, несмотря на всю осторожность, синий цвет имеет тенденцию со временем выцветать.

Зеленая инъекционная масса. Формула Робина (модифицированная).

(1)Arseniate of soda (sat. sol.) 80c.c. Glycerine50 " (2)Sulphate of copper (sat. sol.)40 " Glycerine50 "

Смешайте и добавьте одну часть к трем частям желатиновой массы, приготовленной как для красных и синих инъекций.

Метод инъекции. — При инъекции сосудов тканей необходимо, чтобы орган или все животное, в зависимости от случая, во время инъекции поддерживались при температуре значительно выше той, при которой желатиновая масса расплавится, иначе желатин «застынет» в артериях и никогда не достигнет капилляров. Это нагревание осуществляется путем погружения животного в водяную баню. Разжиженный желатин нагнетается в артерию с помощью шприца или под давлением воздуха. Важно, чтобы давление было равномерным и устойчивым. Это гораздо легче достигается при давлении воздуха, поэтому данный метод настоятельно рекомендуется новичку. Но какой бы метод ни был принят, идеальные результаты могут быть получены с уверенностью только после долгой практики. Иногда применяется слишком высокое давление, и сосуды лопаются, в других случаях инъекция может вообще не достичь капилляров. Самое тщательное внимание к деталям является обязательным.

Безусловно, самым эффективным аппаратом для инъекций является модификация аппарата постоянного давления Людвига, разработанная Фернли. Хотя аппарат кажется сложным, его различные части легко приобрести, а водяную баню можно без труда заменить импровизированным устройством.

Аппарат, показанный на рисунках 10 и 11, состоит из бани, достаточно глубокой, чтобы вместить животное, и сосуда с инъекционной жидкостью. Баня поддерживается при температуре около 110° с помощью обычной горелки Бунзена. Большая трехгорлая склянка Вульфа (емкостью 20–40 унций) снабжена тремя резиновыми пробками, через которые проходят стеклянные трубки. Через центральную пробку почти до дна склянки проходит стеклянная трубка, соединенная резиновым шлангом с обычным шприцем Хиггинсона. Из одного из других горлышек резиновая трубка идет к обычному ртутному манометру, а из третьего — трубка к колбе с разжиженной инъекционной массой, погруженной в водяную баню. Эта колба также плотно закрыта пробкой и должна быть заполнена инъекционным материалом примерно наполовину. Подающая трубка из большой склянки Вульфа должна лишь слегка выступать через пробку. Другая стеклянная трубка проходит почти до дна колбы и соединяется резиновой трубкой с канюлей, вставленной в артерию. Из рисунка 11 очевидно, что при нагнетании воды шприцем Хиггинсона в склянку Вульфа давление в ней будет повышаться (как показывает манометр). Это повышение давления будет в равной степени воздействовать на воздух внутри склянки, содержащей инъекционную жидкость, и жидкость будет вытесняться по трубке через канюлю в артерию.

Fig. 10.—Fearnley’s arrangement for injecting blood vessels. (Repro­duced by permission of Messrs. Macmillan, from Fearnley’s Practical Histology).

Fig. 11.—Scheme shewing distribution of pressure in Fearnley’s Injection Apparatus (from Fearnley’s Practical Histology).

Перед использованием аппарата на выходную трубку сосуда с инъекционной жидкостью следует наложить зажим и повысить давление, чтобы убедиться в герметичности всей системы. Любые утечки должны быть устранены до начала собственно инъекции.

Если необходимо инъецировать изолированный орган, сначала следует ввести в артерию стеклянную или латунную канюлю и надежно закрепить ее лигатурой. Органы, если они холодные, необходимо выдержать в воде при температуре 120° F в течение примерно получаса, а затем перенести в водяную баню.

При инъекции целого животного, такого как кролик, крыса или морская свинка, лучше всего проводить процедуру через несколько минут после смерти. Животное можно усыпить хлороформом, а затем обескровить, вскрыв крупную вену. Как только наступит смерть, сделайте разрез кожи над грудной клеткой по средней линии. Перережьте реберные хрящи справа от грудины, а также место соединения рукоятки и тела грудины. Поскольку эти разрезы проходят по большей части через неваскуляризированные участки, они не приведут к вытеканию жидкости во время инъекции. При насильственном отведении грудины влево обнажится перикард, который необходимо осторожно вскрыть. Необходимо сделать разрез в левом желудочке, ввести канюлю в аорту и прочно закрепить ее лигатурой, проведенной вокруг аорты с помощью пинцета или аневризматической иглы. Кровь удаляют, после чего животное помещают в водяную баню примерно на десять минут. Трубку от склянки с инъекционной жидкостью заполняют путем осторожного нажатия на шприц и зажимают, когда она наполнится. Затем ее конец надевают на канюлю и закрепляют лигатурой. Давление следует повышать, сжимая шприц, пока манометр не покажет один дюйм. После этого зажим следует снять и начать инъекцию. Давление нужно повышать очень осторожно и постоянно, работая шприцем, и наблюдать за состоянием десен, губ и глаз животного. Десны вскоре приобретут розовый оттенок. Лучшие показатели получают, наблюдая за состоянием мелких сосудов склеры. Когда они полностью заполнятся, что произойдет примерно через пять-десять минут в зависимости от скорости повышения давления воздуха, инъекцию можно прекратить. При благоприятных условиях этот результат будет достигнут до того, как манометр покажет давление в пять дюймов. Теперь аорту следует перевязать, а животное поместить в холодную воду, которую часто меняют, до полного охлаждения. Затем органы можно извлечь, поместить в метилированный спирт и подвергнуть фиксации. Впоследствии срезы нарезают и монтируют обычным способом.

ГЛАВА IX.

Указания по подготовке отдельных тканей.

Нормальная гистология. — Начинающему исследователю следует со всей серьезностью внушить, что тщательное освоение нормального вида тканей и органов абсолютно необходимо, прежде чем приступать к точному изучению патологических изменений в них. Ему не следует ограничиваться исследованием одного образца органа, а нужно изучить как можно больше, чтобы быть полностью знакомым со многими отклонениями от нормы, которые могут существовать без наличия заболевания. Поэтому ему следует приобрести несколько животных, таких как небольшие собаки, кошки, кролики, лягушки и т. д., и со всей осторожностью извлечь их органы, зафиксировав их в соответствующих жидкостях. Ему также следует получать образцы нормальных человеческих органов из секционного зала. Многие нормальные ткани (кожа, мышцы, сухожилия, кости и т. д.) также можно подготовить из конечности, ампутированной в результате несчастного случая у здорового пациента. Подготавливая препараты таким образом, он не только станет обладателем набора стекол, иллюстрирующих нормальную гистологию, но и обнаружит, что приобрел тот навык фиксации и окрашивания препаратов, который дает только практика.

Приведенное ниже описание метода подготовки различных тканей предназначено лишь для того, чтобы указать направления, по которым следует двигаться начинающему. После некоторой практики он вполне сможет выбирать способы фиксации и окрашивания, которые могут потребоваться в особых обстоятельствах или случаях.

Первая часть этих указаний будет касаться подготовки нормальных тканей, вторая часть — патологической гистологии.

Кровь. — Специальные методы исследования см. в главе VII.

Кристаллы крови — кристаллы гемоглобина, полученные из крови животного, или их можно собрать в достаточном количестве при любой операции. К крови добавляют немного воды или эфира, дают постоять полчаса, после чего каплю медленно выпаривают на чистом предметном стекле.

Кристаллы гематина. — Студент должен досконально ознакомиться с ними, так как их присутствие служит неопровержимым доказательством наличия красящего вещества крови в пятне.

Чтобы получить их, каплю крови следует высушить на предметном стекле. Высушенную кровь соскабливают в небольшую кучку с помощью кусочка чистого стекла и добавляют каплю ледяной уксусной кислоты. По мере испарения появятся крошечные красновато-коричневые игольчатые кристаллы.

Кристаллы гематоидина. — Получают из места ушиба или старого кровоизлияния, например, при мозговой апоплексии или гематоцеле.

Простой плоский эпителий. — (Эндотелий). Осторожно снимите выстилку париетального перикарда или париетальной плевры недавно убитого животного или расправьте его сальник на кусочке пробки и (1) окрасьте межклеточный цемент нитратом серебра (стр. 82), чтобы выявить контуры клеток. (2) Окрасьте другие препараты гематоксилином или квасцовым кармином для выявления ядер.

Многослойный плоский эпителий. — Следует подготовить образцы кожи различных частей тела: пальца, паха, губы, языка. Фиксировать в жидкости Мюллера.

Переходный эпителий. — Встречается в почечной лоханке, мочеточнике и мочевом пузыре. Он очень легко отслаивается, особенно если его не зафиксировать сразу после смерти. Извлекайте как можно быстрее. Если берется мочевой пузырь, его следует разрезать и расправить как можно ровнее. Фиксировать в осмиевой кислоте или жидкости Мюллера со спиртом. Заливать предпочтительно в целлоидин.

Простой цилиндрический эпителий. — Встречается во многих частях тела. Его можно изучать в слюнных протоках, кишечнике, почках и т. д. любого млекопитающего.

Бокаловидные клетки. — В изобилии встречаются среди цилиндрических клеток кишечных желез, а также в слизистых железах полости рта и шейки матки.

Многослойный цилиндрический эпителий. — Встречается только в уретре. Зафиксируйте пенис кошки в жидкости Мюллера и сделайте поперечные срезы.

Мерцательный эпителий. — Зафиксируйте трахею недавно убитой кошки в осмиевой кислоте или жидкости Мюллера. Прекрасные препараты можно также получить из обычного носового полипа, который следует поместить в фиксирующую жидкость сразу после удаления.

Все срезы эпителия окрашивайте пикрокармином, а также эозином и гематоксилином.

Обычная рыхлая соединительная ткань. — Трудно получить без примеси жира. Ее можно изучать в подкожной ткани уже сделанного среза пениса кошки. Фрагмент ткани также следует извлечь и осторожно расщипать в капле пикрокармина. Рыхлую соединительную ткань можно также изучать на срезах кожи и в капсулах различных внутренних органов.

Эластическая ткань. — Также может быть изучена на большинстве срезов кожи. Если имеется выйная связка крупного четвероногого (лошади, быка) и т. д., она дает лучшие образцы; можно также исследовать желтые связки человека. Растяните кусочек на дереве или воске. Фиксируйте в жидкости Мюллера. Окрашивайте пикрокармином. Следует подготовить как срезы, так и расщипанные препараты.

Сухожилие. — Легко получить из ампутированной конечности. Фиксируйте в жидкости Мюллера. Сделайте поперечные и продольные срезы. Окрасьте эозином и гематоксилином.

Следует также сделать препарат, расщипав немного свежего сухожилия в физиологическом растворе и окрасив пикрокармином.

Ретикулярная или лимфоидная ткань. — Встречается в лимфатических узлах и лимфоидных фолликулах, разбросанных вдоль подслизистого слоя пищеварительного канала.

Подготовьте срезы обычным способом. Окрасьте эозином и гематоксилином или пикрокармином.

Некоторые срезы следует также подготовить путем «промакивания» (т. е. постукивания кисточкой из верблюжьего волоса) или путем встряхивания срезов в пробирке с водой или физиологическим раствором. Благодаря этому лейкоциты удаляются, и структура самой аденоидной ткани становится более заметной.

Жир. — Лучше всего изучать на срезах кожи и подкожной клетчатки или на брыжейке кошки. Один образец следует окрасить осмиевой кислотой и пикрокармином и смонтировать в среде Фарранта, а другой — эозином и гематоксилином и смонтировать в канадском бальзаме.

Пигментные клетки. — Разветвленные клетки лучше всего изучать в живой лапке лягушки, где в них можно наблюдать амебоидные движения при изменении интенсивности света, падающего на сетчатку. Постоянные препараты удобнее всего изготавливать из мантии обыкновенной улитки. Раковину удаляют, мантию вырезают ножницами. Затем ее расправляют, фиксируют в течение дня в метилированном спирте и монтируют неокрашенной в среде Фарранта. Их также хорошо видно на срезах сосудистой оболочки глаза.

Гиалиновый хрящ. — Образцы можно получить из любого сустава, из реберных хрящей молодых животных или из щитовидного хряща и колец трахеи. Его можно фиксировать в спирте. Окрашивайте пикрокармином, эозином и гематоксилином, а также метиловым фиолетовым.

Эластический хрящ. — Подготавливается из надгортанника или хрящей уха, например, кошки. Фиксируйте в спирте. Окрашивайте пикрокармином или разбавленным фуксином.

Волокнистый хрящ. — Получают из межпозвоночного диска. Подготавливайте и окрашивайте так же, как гиалиновый хрящ.

Кость:

Недекальцинированная кость. — Отрежьте как можно более тонкий срез с помощью тонкой пилы. Шлифуйте срез рукой на сухом масляном камне, пока он не станет максимально тонким. Затем приклейте его канадским бальзамом (разжиженным при нагревании) к кусочку стекла и продолжайте процесс шлифовки, время от времени осматривая его при малом увеличении, чтобы увидеть, достаточно ли он тонок. Как только он станет достаточно тонким, его смывают со стекла метилированным спиртом и промывают, чтобы избавиться от мелкой костной пыли. Затем его следует перенести в скипидар и можно монтировать в бальзаме.

Декальцинированная кость. — Образцы можно получить из ампутированной конечности или из бедренной кости кошки.

Образцы следует декальцинировать в хромо-азотной жидкости, а фиксацию завершить в спирте. При изучении процесса оссификации, например, в головке плечевой кости котенка, лучше всего залить образец в целлоидин перед нарезкой срезов, так как костные трабекулы очень хрупкие и легко отрываются.

Очень красивые эффекты двойного окрашивания можно получить с помощью пикрокармина, или эозина и гематоксилина, а также эозина и метилового фиолетового.

Костный мозг. — Чтобы получить хорошие срезы красного костного мозга, возьмите кусочек ключицы, ребра или одной из костей запястья или предплюсны. Декальцинируйте в хромо-азотной жидкости. Залейте в целлоидин. Окрасьте эозином и кампешевым деревом, эозином и квасцовым кармином или квасцовым кармином и пикриновой кислотой. Смонтируйте в канадском бальзаме. Различные клетки, присутствующие в костном мозге, можно также изучить, выдавив немного свежего мозга из ребра, сделав мазок на покровном стекле и подготовив его точно так же, как указано для мазков крови на странице 116.

Зуб. — Лучше всего нарезать in situ из челюсти кошки. Декальцинируйте в хромо-азотной жидкости и сделайте как вертикальные, так и поперечные срезы. Окрасьте пикрокармином или эозином и гематоксилином.

Развивающийся зуб. — Чрезвычайно хорошие образцы можно получить из челюсти новорожденного котенка или щенка. Легко сделать срезы, показывающие молочный зуб и развивающийся рядом постоянный зуб.

Эмаль растворяется декальцинирующими жидкостями. Чтобы изучить ее, следует подготовить образец недекальцинированного зуба в соответствии с указаниями, данными для кости.

Поперечно-полосатая мышца. — Следует изучать на различных животных.

Ножку насекомого, например таракана, можно зафиксировать в осмиевой кислоте. Одну ножку следует зафиксировать в прямом положении, чтобы закрепить фибриллы в полностью вытянутом состоянии, другую следует согнуть, чтобы получить образцы расслабленных фибрилл.

Части мышцы следует извлечь и расщипать на предметном стекле в какой-либо окрашивающей жидкости, такой как пикрокармин, десятый процентный раствор эозина или четвертьпроцентный раствор сафранина.

Следует подготовить срезы мышц амфибий и млекопитающих, чтобы показать их различия в структуре. Наиболее удобной частью для выбора является язык, так как вид волокон получается как в продольных, так и в поперечных срезах. Срезы следует окрашивать эозином и гематоксилином, что дает прекрасный эффект. Специальные методы окрашивания внутримышечных нервных окончаний см. на странице 92.

Сердечная мышца. — Часть следует расщипать в свежем виде в пикрокармине или эозине, другую часть зафиксировать в жидкости Мюллера, сделать срезы и окрасить эозином и гематоксилином.

Гладкую мышцу можно получить, расщипав свежий кусочек мышечной оболочки тонкой кишки животного или сделав срезы фиксированного кишечника, мочевого пузыря или матки. Окрашивайте пикрокармином или, предпочтительно, эозином и гематоксилином.

Нервы. — Специальные методы окрашивания нервных тканей подробно описаны в главе VI. Студент должен помнить, что обычные методы окрашивания также применимы к нервным тканям.

Нервные окончания:

Тельца Мейснера. — Возьмите кончик указательного пальца сразу после ампутации. Поместите его часть сразу в раствор хлорида золота, а остальное — в жидкость Мюллера до фиксации.

Срезы, окрашенные хлоридом золота, следует монтировать в среде Фарранта. Остальные срезы можно окрасить пикрокармином или эозином и гематоксилином.

Тельца Пачини. — Могут быть выделены на мелких ветвях пальцевых нервов или найдены в брыжейке кошки. Последнюю следует расправить на дереве, зафиксировать в жидкости Мюллера, окрасить гематоксилином и смонтировать в бальзаме.

Другие формы осязательных телец можно изучать на языках лягушек, уток или гусей. Сеть нервных фибрилл следует изучать в роговице. Возьмите роговицу недавно убитой лягушки или кошки и окрасьте хлоридом золота (стр. 82).

Концевые пластинки, в которых нервы заканчиваются в мышцах, можно изучать, поместив образцы живой мышцы какого-либо хладнокровного животного в раствор хлорида золота и окрасив довольно интенсивно.

Артерии. — Возьмите кусочек аорты, кусочек какой-либо артерии среднего калибра, например почечной или лучевой, и зафиксируйте в жидкости Мюллера. Окрашивайте пикрокармином и обязательно эозином и гематоксилином. Артериолы лучше всего изучать на срезах различных органов. Так, их можно увидеть в каждом мальпигиевом тельце селезенки, в пограничной зоне почки и так далее. Продольный вид поверхности также можно получить, окрасив и исследовав мягкую мозговую оболочку.

Вены. — Извлекайте, фиксируйте и окрашивайте таким же образом.

Капилляры. — Очень хорошо видны в лапке лягушки.

Оглушите лягушку ударом по голове или хлороформом. Закрепите ее на кусочке картона с V-образным вырезом на одном конце. Привяжите одну из задних лапок с помощью нитей, прикрепленных к пальцам, так, чтобы перепонка лапки была слегка натянута над V-образным вырезом. Затем лапку можно легко исследовать под объективом 1/2 дюйма. Лапку необходимо время от времени смачивать физиологическим раствором, чтобы она оставалась влажной. Движение крови в капиллярах и т. д. можно изучать в течение часа или двух. После смерти брыжейку следует расправить на кусочке дерева и зафиксировать в течение нескольких дней в жидкости Мюллера.

Окрасьте эозином и гематоксилином.

Лимфатические сосуды. — Начало лимфатических сосудов в серозной оболочке. Окрасьте кусочек сальника кошки нитратом серебра (стр. 82) в течение нескольких минут. После промывки подержите в глицерине около недели, затем окрасьте гематоксилином и смонтируйте в среде Фарранта.

Лимфатические узлы. — Можно использовать лимфатические узлы шеи кошки. Фиксируйте в жидкости Мюллера. Окрашивайте пикрокармином, эозином и гематоксилином.

Кожа и потовые железы. — Срезы следует делать из кусочков, взятых (а) с подошвы, (б) с кожи тела, (в) из подмышечной впадины взрослого человека для изучения пигмента. Фиксируйте в жидкости Мюллера. Окрашивайте пикрокармином или эозином и гематоксилином.

Волосы и сальные железы. — Возьмите кусочек кожи головы или кожи щенка. Фиксируйте в жидкости Мюллера. Окрашивайте эозином и гематоксилином, а другие монтируйте неокрашенными.

Волосы с различных частей тела следует также вымочить в течение нескольких часов в liq. potassae и смонтировать неокрашенными в среде Фарранта. Впоследствии их можно обесцветить обработкой водой Жавель (стр. 27).

Головной и спинной мозг. — Должны быть извлечены из тела с особой осторожностью, избегая любого растяжения или сдавливания. Фиксируйте медленно в жидкости Мюллера, к которой можно добавить четверть ее объема воды.

Лучшими окрашивающими реагентами являются эозин и гематоксилин, квасцовый кармин или бура-кармин, анилиновый сине-черный и т. д. Методы окрашивания см. в главе VI.

Глаз. — Зафиксируйте глаз недавно убитого быка, кошки или другого животного в формале (стр. 23), проколов склеру в нескольких местах, чтобы фиксирующая жидкость могла проникнуть внутрь. Примерно через неделю сделайте горизонтальный срез через глаз. Переднюю половину (после удаления хрусталика) можно удовлетворительно нарезать в камеди. Срезы хрусталика не очень удачны. Лучший способ получить образцы волокон — расщипать кусочек свежего хрусталика рыбы (например, трески) в 1/40-процентном водном растворе эозина. Смойте эозин с предметного стекла 1/2-процентным раствором уксусной кислоты и смонтируйте в растворе Фарранта.

Заднюю половину глаза следует залить в целлоидин, так как в противном случае крайне трудно получить срезы сетчатки в ее правильном соотношении с другими оболочками.

Некоторые образцы монтируйте неокрашенными. Другие окрасьте обычными красителями.

Внутреннее ухо. — Декальцинируйте височную кость кошки, собаки, морской свинки и т. д. в хромо-азотной жидкости. Как только кость декальцинируется, завершите фиксацию мягких частей в метилированном спирте, залейте в целлоидин и сделайте срезы вдоль продольной оси улитки. Из-за чрезвычайной твердости кости у взрослых особей лучше всего использовать каменистую часть височной кости новорожденных животных.

Полукружные каналы легче всего изучать в височной кости рыб или птиц, например, обычной курицы. Их также необходимо нарезать в целлоидине и окрасить обычным способом.

Нос и обонятельный эпителий. — Трудно получить образцы от человека, но очень удовлетворительные препараты можно сделать из собаки или, что удобнее, из новорожденного щенка, у которого кости еще хрящевые. Последние фиксируйте в жидкости Мюллера, взрослые образцы декальцинируйте в хромо-азотной жидкости. Образцы мерцательного эпителия и т. д. будут получены из нижней части, а специального обонятельного эпителия — из верхней части. Окрашивайте эозином и гематоксилином.

Легкие. — Осторожно извлеките легкие кошки, не повреждая бронхи или трахею. Введите канюлю в трахею и осторожно надуйте ее воздухом. Перевяжите трахею и поместите легкое в жидкость Мюллера, прикрепив груз, чтобы орган оставался погруженным. Фиксируйте около шести недель, а затем сделайте срезы различных частей.

Чтобы продемонстрировать эндотелий альвеол, вместо воздуха введите нитрат серебра. Оставьте на полчаса, затем удалите промыванием и зафиксируйте в жидкости Мюллера.

Прекрасные слепки альвеол и т. д. можно получить, поместив легкое кошки или человека под колокол воздушного насоса и, когда воздух будет полностью откачан, введя легкоплавкий металл в бронх. Затем ткань легкого удаляется путем коррозии или мацерации. Части слепков следует извлечь, закрепить в стеклянной ячейке с помощью капли канадского бальзама и исследовать в отраженном свете.

Щитовидная железа. — Лучше всего получать от молодого субъекта, человека или животного.

Фиксируйте в жидкости Мюллера. Окрашивайте пикрокармином или эозином и гематоксилином. Также окрашивайте срезы сафранином, который окрашивает коллоидный материал, а также выявляет любое коллоидное образование в самих клетках.

Тимус. — Извлеките из плода или очень молодого животного и подготовьте обычным способом.

Язык. — Язык кошки или кролика подходит очень хорошо.

Следует сделать обычные поперечные срезы, а также срезы через желобоватые сосочки, чтобы изучить «вкусовые почки».

Слюнные железы. — Железы кошки или собаки подходят очень хорошо.

Срезы следует сделать из каждой из трех желез.

Желудок. — Следует изучать желудок кошки или собаки. Орган должен быть извлечен сразу после смерти, до того как произойдет посмертное переваривание оболочек. Желудок следует вскрыть, осторожно промыть и расправить, как можно меньше растягивая, на кусочке дерева и зафиксировать в жидкости Мюллера.

Срезы следует сделать (а) продольно через кардиальный отдел, чтобы показать переход от пищеводной к желудочной слизистой оболочке, (б) из части большой кривизны, (в) продольно через привратник.

Эозин и гематоксилин — лучший краситель для пищеварительного канала.

Кишечник. — Подготавливайте так же, как желудок. Сделайте срезы из (а) верхней части двенадцатиперстной кишки, чтобы показать железы Бруннера, (б) подвздошной кишки, (в) пейеровой бляшки, (г) червеобразного отростка, (д) толстой кишки.

Печень. — Сделайте инъекцию одного образца кармином и желатином (стр. 120). Фиксируйте в метилированном спирте. Другие следует фиксировать в жидкости Мюллера и окрашивать обычным способом.

Почка, надпочечник и поджелудочная железа. — Такая же подготовка, как для печени.

Селезенка. — Фиксируйте в жидкости Мюллера.

Один срез смонтируйте неокрашенным. Другой встряхните с водой в пробирке, чтобы показать структуру пульпы. Остальные окрасьте эозином и гематоксилином.

Мочевой пузырь. — Должен быть извлечен и расправлен сразу после смерти, иначе эпителий будет мацерирован. Следовательно, его нужно брать от животного, например, кошки. Фиксируйте в осмиевой кислоте. Нарезайте в целлоидине, так как оболочки очень склонны к отслоению.

Пенис и семенник. — Легко получить от собаки, кошки или крысы.

Окрашивайте эозином и гематоксилином.

Матка, яичники и фаллопиевы трубы. — Можно получить из секционного зала или от низших животных. Фиксируйте в жидкости Мюллера и сделайте срезы из шейки матки, тела матки, фаллопиевой трубы и яичника.

Окрашивайте эозином и гематоксилином.

Эмбриологические образцы. — Для систематической работы следует обращаться к специальным руководствам.

Образцы следует фиксировать в осмиевой кислоте или жидкости Мюллера и нарезать в целлоидине или парафине.

Мутное набухание. — Образцы получают из органов субъектов, умерших на ранней стадии какой-либо лихорадки. Их всегда следует фиксировать в жидкости Мюллера, так как внешний вид меняется, если ткань долго держать в спирте.

Жировая дистрофия. — Подготавливайте от пациентов, умерших от истощающих заболеваний, фосфорного отравления и т. д.

Окрашивайте осмиевой кислотой. Монтируйте в среде Фарранта и храните в темноте.

Слизистая дистрофия. — Изучайте в бокаловидных клетках нормального кишечника или кист яичников. Не существует удовлетворительных селективных красителей для муцина.

Коллоидная дистрофия. — Встречается в щитовидной железе, в канальцах почек при многих заболеваниях и в предстательной железе у пожилых людей.

Окрашивайте сафранином.

Восковидная или амилоидная дистрофия. — Лучше всего изучать в печени, селезенке или почках. Ее следует искать у лиц, умерших от длительной болезни, сопровождавшейся нагноением, например, чахоткой или болезнью костей. Один срез смонтируйте неокрашенным, другой окрасьте метиловым фиолетовым, третий — слабым раствором йода, и исследуйте последний сразу как в проходящем, так и в отраженном свете. Йодное окрашивание не является постоянным. Еще один срез следует окрасить осмиевой кислотой с последующим метиловым фиолетовым, так как восковидная и жировая дистрофии часто сосуществуют.

Гиалиновая дистрофия. — Наблюдается в артериолах селезенки в некоторых случаях брюшного тифа и дифтерии. Необходимо использовать обычные методы окрашивания.

Известковая дистрофия. — Возникает после жировой дистрофии в гуммах и атероматозных артериях. Она также встречается в матриксе реберных хрящей после среднего возраста. Смонтируйте один срез неокрашенным и исследуйте, если возможно, с помощью полярископа. Остальные окрасьте сафранином.

Пигментная дистрофия. — Можно изучать при бурой атрофии сердца, мускатной печени и т. д. Она также хорошо видна в спинномозговых и церебральных нервных клетках у пожилых людей. Фиксируйте в жидкости Мюллера и монтируйте срезы неокрашенными.

Нет необходимости повторять методы фиксации различных пораженных органов, так как указания для нормальных органов остаются в силе. Если подозревается наличие микроорганизмов, фиксируйте в метилированном спирте или абсолютном алкоголе, но, как правило, как для пораженных органов, так и для опухолей, жидкость Мюллера окажется наиболее удовлетворительным реагентом для общего использования.

Иногда, однако, неудобно ждать несколько недель, пока жидкость Мюллера достаточно зафиксирует образец, прежде чем делать срезы. В этом случае лучший план — сделать свежие срезы или же отрезать ломтик толщиной около одной восьмой дюйма и фиксировать около трех дней в большом количестве метилированного спирта или в формале (стр. 23).

Опухоли. — Следует использовать жидкость Мюллера, если не требуется более быстрый агент.

Метилированный спирт можно использовать в случае эпителиомы, аденомы и т. д., но для саркомы, миксомы, опухолей, содержащих кисты или много крови, жидкость Мюллера дает наилучшие результаты.

СПРАВОЧНАЯ ЛИТЕРАТУРА.

Методы в микроскопической анатомии — Уитмен. Практическая патология — Вудхед. Учебник бактериологии — Крукшенк. Руководство для физиологической лаборатории — Харрис и Пауэр. Практическая гистология — Фернли. Практическая патология и гистология — Гиббс. Журнал Микроскопического общества. Методы и формулы — Сквайр. Человеческий мозг — Гудолл. Практическая бактериология — Кантхак и Драйсдейл. Методы микроскопических исследований — Коул.

ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ.

Конденсор Аббе, 11. Абсолютный спирт, 21. Ацетат меди, 89. Пузырьки воздуха, удаление, 56. Квасцовый кармин, 76. Квасцовый гематоксилин, 68, 70. Амилоидная дистрофия, 149. Анилиновый сине-черный, 94. Анилиновое масло, 102, 108. Анилиновая вода, 107. Необходимая аппаратура, 1. Рыхлая соединительная ткань, 133. Бактерии, красители для, 103. Склянка для бальзама, 58. Раствор кампешевого дерева Барретта, 69. Метод Бевана Льюиса, 94. Бихромат калия, 17. Коричневый Бисмарк, 104. Обесцвечивающий раствор, 27. Кристаллы крови, 130. Кровь, методы исследования, 113. Кровеносные сосуды, инъекция, 120. Синяя инъекционная масса, 121. Костный мозг, 136. Кость, срезы, 136. Бура-кармин, 75. Головной мозг, методы окрашивания, 94. Модификация метода Гольджи Бакли, 99. Известковая дистрофия, 149. Раствор канадского бальзама, 61. Карболовая кислота, 23. Кармин, 74. Инъекционная масса, 120. Микротом Кэткарта, 39. Микротом Кэткарта-Фрейзера, 42. Кедровое масло, 8, 63. Целлоидин, 30. Цементирование покровных стекол, 65. Хлоральный гематоксилин, 92. Хлорид золота, 82, 94. Хромо-азотная декальцинирующая жидкость, 26. Мерцательный эпителий, 132. Кровообращение в лапке лягушки, 141. Просветление срезов, 63. Просветляющие агенты, 63. Мутное набухание, 148. Гвоздичное масло, 63. Коллоидная дистрофия, 149. Цилиндрический эпителий, 132. Фиксация сулемой, 23. Окрашивание, 100. Покровные стекла, очистка, 57. Препараты на покровных стеклах, 111. Декальцинирующие растворы, 26. Обезвоживание, 63. Вода Жавель, 27. Раствор Эбнера, 27. Жидкость Эрлиха-Бионди, 85. Гематоксилин Эрлиха, 70. Метод фиксации мазков крови Эрлиха, 116. Метод Эрлиха для туберкулезных бацилл, 110. Метод Эрлиха-Грама для окрашивания бактерий, 108. Эластический хрящ, 135. Эластическая ткань, 133. Методы заливки, 29. Эндотелий, 131. Эозин, 72. Эозин и гематоксилин, 73. Эпителиальный цемент, 131. Микротом с эфирным распылением, 39. Фекалии, окрашивание на бациллы, 112. Раствор Фарранта, 59. Жир, удаление из срезов, 59. Окрашивание жира, 134. Жировая дистрофия, 148. Инъекционный аппарат Фернли, 123. Раствор фуксина Феррье, 117. Раствор Флемминга, 25. Флотация срезов, 55. Складчатые срезы, обработка, 58. Формал, 23. Свежие срезы, 52. Фуксин, 104. Генцианвиолет, 104. Краситель Гиббса для туберкулезных бацилл, 111. Хлорид золота, 82, 94. Серебряный метод Гольджи, 96. Сулемовый метод Гольджи, 99. Йодный раствор Грама, 105. Метод Грама для окрашивания бактерий, 107. Зеленая инъекционная масса, 122. Камедь, 29. Кристаллы гематина, 131. Гематоидин, 131. Гематоксилин Эрлиха, 70. Гематоксилин Клейненберга, 70. Гематоксилин Шухарда, 68. Хлоральный гематоксилин Зилера, 92. Гематоксилин Вейгерта, 88. Кристаллы гемоглобина, 130. Процессы фиксации, 15. Гиалиновый хрящ, 135. Гиалиновая дистрофия, 149. Ледяной замораживающий микротом, 46. Иммерсионные линзы, 8. Инъекция кровеносных сосудов, 120. Инъекция легочных альвеол, 145. Внутреннее ухо, 143. Кишечник, 146. Йодный раствор, 105. Микротом с эфирным распылением Юнга, 45. Гематоксилин Клейненберга, 70. Амилоидная дистрофия, 149. Литиевый пикрокармин, 79. Литиевый кармин, 74. Печень, 147. Метиловый синий Леффлера, 104. Кампешевое дерево, 68. Лимфоидная ткань, 134. Жидкость Марки, 24. Костный мозг, 136. Метиловый синий, 101, 104. Метиловый фиолетовый, 83. Метилированный спирт, 19. Микроорганизмы, красители для, 103. Микроскоп, 6. Микротом Беккера, 49. Кембриджский качающийся микротом, 49. Кэткарт, 39. Кэткарт-Фрейзер, 42. Юнг, 45. Шанце, 47. Свифт, 49. Уильямс, 46. Форма для заливки в парафин, 36. Методы монтажа, 55. Слизистая дистрофия, 148. Мышца, 138. Метод фиксации мазков Мьюира, 116. Жидкость Мюллера, 17. Жидкость Мюллера и формал, 20. Жидкость Мюллера и спирт, 20. Краситель Нильсена для туберкулезных бацилл, 110. Нервные клетки, красители для, 94. Нервные окончания, 139. Нервные волокна, красители для, 87. Анилиновый метод Ниссля, 101. Нитрат серебра, 82. Азотная кислота как фиксирующий агент, 25. Азотная кислота как декальцинирующий агент, 26. Азотная кислота как обесцвечивающий агент, 110. Нормальный физиологический раствор, 53. Револьверная головка, 9. Объективы, 7. Бергамотовое масло, 63. Кедровое масло, 8, 63. Гвоздичное масло, 63. Масло душицы, 63. Осмиевая кислота как фиксирующий агент, 21. Осмиевая кислота как окрашивающий реагент, 81. Метод Паля, 86. Раствор Паля, 90. Парафин, 34. Пикрокармин, 78. Пигментные клетки, 134. Пигментная дистрофия, 150. Плоский нож микротома, 42. Быстрая фиксация, 150. Сетчатка, 143. Сафранин, 85. Слюнные железы, 146. Метод Шефера-Паля, 91. Микротом Шанце, 47. Гематоксилин Шухарда, 68. Хлоральный гематоксилин Зилера, 92. Нитрат серебра, краситель для нервных клеток, 96. Эпителиальный цемент, 131. Кожа, 142. Спинной мозг, 86, 142. Селезенка, 147. Мокрота, окрашивание, 111. Плоский эпителий, 131. Методы окрашивания, 67 и след. Желудок, 146. Поперечно-полосатая мышца, 138. Серная кислота, 105. Потовые железы, 142. Сухожилие, 133. Проверка микроскопа, 13. Тимус, 145. Щитовидная железа, 145. Жидкость Туазона, 118. Зуб, срезы, 137. Переходный эпителий, 132. Туберкулезная бацилла, красители для, 110. Опухоли, фиксация, 150. Гладкая мышца, 139. Моча, исследование на бациллы, 112. Матка, 148. Декальцинирующий раствор фон Эбнера, 27. Восковидная дистрофия, 149. Метод гематоксилина Вейгерта, 88. Метод Вейгерта для окрашивания бактерий, 106. Ледяной замораживающий микротом Уильямса, 46. Инъекционная масса Вудхеда, 120. Ксилол, 61. Карбол-фуксин Циля, 105.

СНОСКИ:

1 Студент должен помнить об опасности работы с бензином вблизи открытого огня.

2 «Практическая гистология» (Macmillan & Co.).

The Project Gutenberg eBook of Section Cutting and Staining, by W. S. Colman.